30.10.2007

Полимеразная цепная реакция (ПЦР).

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) – это высокоэффективная реакция, при которой происходит амплификация (селективное умножение) специфических последовательностей ДНК до такого уровня, когда их можно определить методом электрофореза или другими методами.

ПЦР используемая на практике для ранней диагностики ВИЧ позволяет определить провирусную ДНК, геномную РНК вируса.

Выявление ВИЧ и его антигенов необходимо для ранней диагностики перинатального заражения у детей первых лет жизни, т.к. материнские антитела класса G проникают через плаценту.

У взрослых эти исследования необходимо проводить в серонегативном периоде, при неопределенных результатах иммуноблота и для контроля эффективности проводимого лечения.

Диагностика ВИЧ-инфекции у детей до года и старше, родившихся от ВИЧ-инфицированных матерей, представляет определенные трудности. Это обусловлено тем, что как уже упоминалось, в крови новорожденных (иногда до 12-15 месяцев) циркулируют материнские антитела класса G и у детей первого года жизни нет репликации ВИЧ. В таких случаях ни вирус, ни его геном не выявляются. В этом периоде можно обнаружить лишь р24.

Принцип диагностики ВИЧ-инфекции у детей до года следующий:

С помощью ПЦР выявляют ВИЧ. Независимо от результатов такого исследования (положительный или отрицательный) его повторяют через 2-4 месяца и определяют р24. При положительном результате ВИЧ-инфекция подтверждается, при отрицательном (отсустсвие р24) – нет ВИЧ-инфекции. У детей старше года вначале определяют антитела методом ИФА. При отрицательном результате – инфекция исключается, при положительном – проводится подтверждение в иммуноблоте. В случае положительного результата иммуноблота диагноз ВИЧ-инфекции подтверждается, при отрицательном результате этот диагноз исключается.

Недостаток метода – необходимость дорогостоящего оборудования и достаточно высокая стоимость расходных материалов.

Для исследования используется венозная кровь в количестве 3-5 мл. Кровь забирается стерильным способом в специальные пробирки (вакутайнеры с ЭДТА). После взятия кровь аккуратно смешивается с антикоагулянтом путем переворачивания пробирки 8-10 раз. Хранение и транспортировка образцов проводится при температуре 2 – 8 градусов С. Исследование желательно проводить не позже 48 часов от момента забора крови. Следует помнить, что гепарин угнетает ПЦР. Транспортировка образцов крови проводится в сумках-холодильниках или контейнерах с соблюдением холодового режима.

Определение количественного показателя присутствия ВИЧ.

Концентрация РНК ВИЧ в крови, так называемая “вирусная нагрузка”, в настоящее время считается одним из основных лабораторных маркеров прогрессирования ВИЧ-инфекции.

Под «вирусной нагрузкой» подразумевают количество РНК- копий вируса в 1 мл крови.

Повышение вирусемии является наиболее ранним признаком начинающегося прогрессирования заболевания и неблагоприятным прогностическим симптомом. Концентрация РНК ВИЧ измеряется в количестве копий РНК ВИЧ в миллилитре крови. Иногда этот показатель измеряется в десятичных логарифмах (log10). «Вирусная нагрузка» от 500 до 10000-30000 копий в 1 мл крови соответствует ВИЧ-инфицированности, от 30000 до 100000 копий в 1мл крови соответствует ВИЧ ассоциированному комплексу, более 100000 копий в 1 мл- СПИД.

Поскольку в каждом вирусе иммунодефицита человека содержатся две копии РНК количество вирусных частиц в крови в два раза меньше чем показатель “вирусной нагрузки”. Показатель “вирусной нагрузки” используется для определения показаний к началу антиретровирусной терапии и быстрой оценки ее эффективности. «Вирусная нагрузка» более 60000 копий РНК ВИЧ в миллилитре крови является показанием к началу антиретровирусной терапии. Значимым изменением концентрации РНК ВИЧ считается разница в показателе, по сравнению с предшествующим уровнем, не менее чем в 3 раза. При эффективной антиретровирусной терапии уже к 4-8 неделе отмечается снижение уровня РНК ВИЧ в 3-5 раз. К 12-16 неделе лечения у большинства пациентов уровень РНК ВИЧ становится неопределяемым.

Острые инфекционные заболевания (не обязательно связанные с ВИЧ-инфекцией) и вакцинация могут временно повышать уровень вирусной нагрузки. Поэтому результаты исследования, проведенные в течение 4 недель после таких

эпизодов, не могут рассматриваться как критерии к назначению терапии. В этих случаях показано повторное обследование.

ТРЕБОВАНИЯ К РАЗМЕЩЕНИЮ ЛАБОРАТОРИЙ.

Выделение помещений под лабораторию или реконструкция существующих помещений проводится по согласованию с режимной комиссией (городской или областной). После проведения подготовительных работ требуется получение разрешения Центральной режимной комиссии Минздрава РУз на работу с возбудителями инфекций 3-4 группы патогенности. Необходимо предусмотреть поточность движения патогенного материала.

Лаборатория должна располагаться в отдельном здании, этаже или изолированном помещении учреждения с отдельным входом, должна иметь незаразное и заразное отделения.

В незаразном отделении должны быть помещения для верхней одежды, приема пищи, для отдыха сотрудников, лаборантская, врачебная комната, склад для хранения инвентаря, дезинфицирующих средств, туалетная и душевая.

В заразном отделении необходимо иметь комнату для приема и регистрации поступившего на исследование материала, комнату для разборки и подготовки сывороток к серологическим исследованиям, серологическую, комнату для обеззараживания обработанного материала, моечную, стерилизационную.

ПРАВИЛА РАБОТЫ В ЛАБОРАТОРИИ, ОБЕСПЕЧЕНИЕ ПРОТИВОЭПИДЕМИЧЕСКОГО РЕЖИМА

Диагностическая лаборатория СПИД осуществляет определение антител к ВИЧ методом ИФА в сыворотке крови согласно с СанПиН № 0187 2005 г «О проведении медицинского обследования на ВИЧ/СПИД».

Работа в лаборатории осуществляется в соответствии с правилами противоэпидемического режима работы с возбудителями 3-группы патогенности. При поступлении на работу необходимо пройти инструктаж по соблюдению санитарно-гигиенического и противоэпидемического режима.

Подобные инструктажи должны проводиться для всех сотрудников лаборатории не реже, чем 2 раза в год.

Врачи диагностических лабораторий СПИД должны проходить усовершенствование в ИУВ 1 раз в 5 лет, первичную специализацию на рабочем месте в РЦ СПИД, а заведующие областных центров СПИД 1 раз в 3 года. Лаборанты – проходят усовершенствование в Центрах по усовершенствованию среднего медицинского работника 1 раз в 5 лет и первичную специализацию на рабочем месте в РЦ СПИД. В дальнейшем каждые 3 года лаборанты проходят усовершенствование в областных Центрах СПИД.

Работа в заразном отделении лаборатории проводится в противочумном костюме 3-типа (хирургический халат, шапочки или косынка, резиновые

перчатки, носки, тапочки). Необходимо надевать маски или пользоваться защитными экранами. Перед работой все повреждения на коже должны быть закрыты лейкопластырем или напальчниками. Перед каждым надеванием перчаток нужно проверять их целость, для чего их нужно наполнить воздухом и посмотреть, нет ли утечки воздуха.

Прежде чем приступать, к работе необходимо приготовить, дезинфицирующие растворы и подготовить рабочие места к приему материала и проведению анализов.

При работе с тестируемыми образцами следует обращаться как с потенциально инфекционным материалом.

Работа с присланным на исследование материалом проводится в перчатках с соблюдением мер предосторожности. После приема материала направления образцов помещают в термостат на 60-80^оС для обеззараживания. Образцы крови (сыворотки) перекладывают в штативы диагностической лаборатории, помещенные на подносы, и переносят в комнату для разборки и подготовки материала. Контейнеры, в которых доставлен материал и штативы, обрабатываются дезинфицирующим раствором. Поступивший для исследования материал регистрируется в журнале.

По завершении анализов производится дезинфекция рабочих столов и других предметов, используемых в работе, производится обеззараживание обработанного материала.

Перчатки перед снятием протирают тампоном с 70º спиртом или 6% раствором перекиси водорода, затем моют теплой водой с мылом. Снятые перчатки погружают в сосуд с дезинфицирующим раствором и придавливают грузом, руки протирают тампоном, смоченным 70º спиртом, и моют теплой водой с мылом. Для вытирания обработанных перчаток и рук должны быть отдельные полотенца. С целью обеспечения безопасности медперсонала лаборатории, работающих в боксе, сотрудникам необходимо использовать одноразовые резиновые перчатки.

Во время перерыва в работе в связи с производственной необходимостью или по экстренным причинам также дезинфицируются рабочие столы, обрабатываются перчатки и руки.

Использованные пробирки с образцами, пипетки и другие помещают в емкости (эксикатор, эмалированное ведро, кастрюля) заливаем 3% раствором хлорамина или 3% раствором осветленной хлорной извести или 6% раствором перекиси. Время экспозиции не менее 6 часов при закрытой крышке. Поверхности аппаратов протираются 96º этиловым спиртом.

В конце рабочего дня проводится влажная уборка всего помещения лаборатории с применением дезинфицирующих средств (моют полы, протирают стены, двери, потолки, подоконники, окна, шкафы и т.д.). После уборки рабочие комнаты облучают бактерицидными лампами в течение 60 минут. Мощность облучения должна составлять не менее 2,5 вт.куб.м.

Термостаты, холодильники, шкафы или двери рабочей комнаты, где они находятся, запираются или пломбируются.

Запрещается в заразном отделении принимать пищу, курить, вносить и хранить посторонние вещи (сумки, верхнюю одежду) и т.д.

В помещениях лаборатории (заразном и незаразном) не менее 2 раз в день проводится влажная уборка с применением дезинфицирующих средств.

После ухода сотрудников лаборатория закрывается на замок и опечатывается ответственным лицом или дежурным.

В лаборатории должны находиться укомплектованные аптечки и необходимые средства на случай экстренной помощи при аварийной ситуации:

- Резиновые перчатки 3 пары

- Напальчник 4 шт.

- Ножницы 1 шт.

- Перманганат калия в навесках 0.1, 3 навески, емкость для разведения перманганата калия с маркировкой 1 литр.

- Этиловый спирт 70% 100 мл.

- Настойка йода 5% 30 мл.

- Раствор перекиси водорода 6% - 0,5 л

- Маски 4 слойные 3 шт.

- Мешок пластиковый большой емкости для сбора загрязненной одежды 1 шт.

- Дез. средства: хлорамин 30 гр каждый или разрешенные для применения другие средства.

- Емкость для разведения дез. средств 1 шт.

- Раствор проторгола 1% 1 флакон

- Раствор альбуцида 30% 1 флакон

- Борная кислота 1% 100 мл